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    公开号:WO1992000324A1
    申请号:PCT/JP1991/000871
    申请日:1991-06-27
    公开日:1992-01-09
    发明作者:Tamotsu Hashimoto；Ken-Ichi Tezuka；Masayoshi Kumegawa；Sunao Takeshita
    申请人:Hoechst Japan Limited；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 細胞分化形成能を有する新規な蛋白質と その遺伝子工学的製法 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 骨細胞分化形成能および脳細胞分化形成能を 有する新規な蛋白質、 それをコー ドする D N Aおよびその 遺伝子工学的製法によるこの蛋白質の製造方法に関する。 背 景 技 術
    [0003] K a d 0 m a t s u 等 (K a d o m a t s u e t a 1. 1988, B i o c e m. Bi oply s. Res. Comniun, Vo .151, Pages 1312-1318) はマ ウスの胚性奇形癌腫細胞の初期発生の過程で特異的に発現 する高塩基性の リ ジン残基に富む MK 1 と名付けた分子量 9， 971ダル ト ンのポ リペプチ ドをコー ドする遺伝子を見つ けた。 彼 ら は （ K a d 0 m a t s u e t a I. 1990, J. o f Ce l l Biol. , Vo .110, Pages 607 - 616 ) 更にこのペプチ ドが分 泌性のものであるこ とを明らかにし、 T G F (Trans forming growth f actor) - βフ τ ミ リ ーに属する蛋白質のよう に細胞の成長分化に関与するホルモンであることを示して いる。 T G F - βつ マ ミ リ ーの蛋白質は最近 B M P (Bone Mo rphogen i c Protein)と呼ばれる一連の骨形成に関与する 蛋白質の存在が報告されており骨折治療への応用が期待 されてい る （た とえば Wozney e t a 1. 1988 , Sc i ence, Voi.242, Pages 1528 - 1534 ) 。 また、 脳細胞に由来する蛋 白質性の成長因子と しては、 N G F (Nerve grovth factor) 等が報告されており、 その医学領域での応用が期待されて いる。
    [0004] 老人性の疾患と しての骨粗ショ ゥ症及び痴呆症は近年 益々先進工業国において深刻な社会問題となりつつあり、 その患者数も増加の傾向にある。 従って骨形成細胞及び脳 細胞に特異的に発現される遺伝子及びその生産物はそれら の治療に新しい道を開く可能性を秘めている。
    [0005] 発 明 の 開示
    [0006] 本発明者は、 マウス頭蓋冠由来の骨形成細胞 （ォステ オプラス ト） 様の性質を持つ細胞株 M C 3 T 3 E 1 におい て特異的に発現 している c D N Aク ロー ンを分離し同 c D N Aク ローンが新規な蛋白質をコ一 ドすることを見い だした。 本発明者はさ らに、' このマウス由来の新規な蛋白 質をコー ドする c D N Aをプローブと して用い、 ヒ ト細胞 より作成した c D N Aライブラ リーからヒ ト由来の本蛋白 質をコー ドする c D N Aク ローンをも分離同定した。
    [0007] 本発明で得られる蛋白質は MKフ ァ ミ リ ーと呼ばれる一 種の細胞分化または成長因子のフア ミ リ ーに属するァ ミ ノ 酸 168個からなる蛋白質である。 この蛋白質をコー ドする m R N Aはマウスの腎細胞、 脾臓細胞、 胸腺細胞、 肝臓細 胞、 肺細胞、 骨格筋細胞では発現せず、 M C 3 T 3 E 1細 胞で強く、 また脳細胞と N I H 3 T 3細胞では弱く発現す 。
    [0008] 本発明はまず、 下記の配列 〔 I〕 で表されるァ ミ ノ酸残 基を有する蛋白質からなるものである。
    [0009] Met-A*l-A*2-Gln-Gln-Tyr-Gln-Gln-Gln-Arg-Arg-Lys-Phe-Ala-Ala-
    [0010] Glu-AJLa-Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys -Val-Lys-Lys-Ser-
    [0011] Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln-Trp-Ser-Val-Cys-Val-Pro-Thr-Ser-Gly-- Asp - Cys - Gly— Leu - GIY - Thr - Arg - Glu - Gly— Thr - Arg- Thr - Gly- Ala-Glu— Cvs-Lys-Gln-Thr-Met—Lvs—Thr-Glxi-A g-Cys-Lys-Ile—Pro-Cys-Asii— Trp-Lys-Lys-Gln-Phe-Gly-Ala-Glu-Cys-Lys-Tyr-Gln-Phe-Gln-Ala- Trp-Gly-Glu-- Cys -Asp-Leu -Asn- T r-Ala-Leu-Lvs -Thr-Arg- Thr-Gly- Ser-Leu— Lvs— Arg— Ala - Leu- His - Asn - Ala - A*4 - Cys - Gln-Lys - Thr - Val— Thr-Ile-Ser-Lys-Pro-Cvs-Gly-Lys-Leu-Thr-Lys-Pro-Lvs-Pro-Glii- Ala - Glu— Sear - Lys - Lys - Lys— Iys - Lys - Glu— Gly - Lys—Lys—Gln—Glu—Iiys - Met— Leu - Asp
    [0012] 〔 I 〕
    [0013] 配列中、 A * 1 は S e r力、 G 1 n、 A * 2 は S e rか A 1 a、 A * 3は L euか P heヽ A * 4は Aspか G lu、 である。
    [0014] 本発明の蛋白質の好適な例は下記の配列 〔 I - I〕 又は 〔 I - Π〕 で表わ さ れる マ ウ ス O S F - 1 又は ヒ ト 0 S F - 1 と名付けられる蛋白質である。 〔Π - I〕
    [0015] — s« i— rr )— て3— SAT;— sAq;— Λて 一 ri[£i一 ε τ;— SAT;— s τ:— εΑτ:— ·^Ί—ュ 3S— nて 3—
    [0016] — IXて 3— or — s 一 oュ d— s T ュ xii— ST;— S x— て)— s っー 0ュ3— SA —ュ as— 3てエー: z j; —て B v— :i
    [0017] — Aて 3—ュ i— β^Υ-ユ^ !«— S^T:— — Bて :r c— χιε·γ— ΠΒΤ:— <3 — s :)— riて)一 — d ^ 一 *ε — tiて 3— — IIて )— ijQ— S T:— s^ —ひて 3— " eT — T)—3 <i_uTS—sArI—SifI-<i:r
    [0018] 一ひ — s 0— oュ d— 3てエー s Ί一 s^O— 5ュ Y—ひて —ユ^ I；一 SAT;—: an—ュ ェ— uて 3— s Ί一 SAQ 一 nて 3— eて γ— て>—ュ q£— β^τ¾·—ュ1^ Q— て 3— て £)— β Γ¾"— ^て 3— て )-s l一 ds^f 一 Λて 3—ュ as—ュ o:r<j—て Λ— s^ —て —ュ as— <ir«L— IIて 3— nて 3—^て 3— つ一 ds
    [0019] 一: res— — SAT;—て — s q:— s 1!一 て 3— O:T(J— s q:— IIて £— S ^I-SAT:— て 3— T — riて f)
    [0020] Si — "e - tii— ds"¾;—て ΒΛ— Βχ — ST — τΐ3*ι— 3てェ一 a <2— 3てェ
    [0021] — て ¾"-3t{ — s >i— 一 uて )一 uて —ユ^ϋ一 uて 5)-111：3— —11て 3- ^ H
    [0022] c I - n
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    [0025] — tiて 3— 3q<j— uて 3—ュ £一 SAT;— 5^コ一 tiて 3— Β ¾·— て £)一 — tiTf一 Sirr— s >l-d^ェ
    [0026] - USY - 3 コ_0ュ<3： - 3てエ- s_<¾- ε - £ュ¾： - Iて 3 -: τςϋ - s_<¾— eH-ェ - て 3 - s 一 s^o 5 -tiて 3-Bて γ— Λて s-rcqi-S y—ュ q -^て 一 nて 3-·5:τ¾·-ュ qェ — nsi- て 3— s o-ds^f — て 3—ュ as—ュ：！ 一 0ュ<1— TSA— て —r3S_ir;—iて 3_<i ー nて て 3— s d_ds¾" -■ ss- S iT:-
    [0027] 一 Β"ΓΥ—ュ q£— εγ—て ΒΛ— ·ε — STY— Π3Ί— 3てェ一 sti<2— 3てェ _na«i— ST — nsq;— 3 3— ST
    [0028] - STS"—Bて γ一 sqa—s - ·ο:ι - ·5· ¾·—ΐχχ3 - 一 trif)一ュ 一∑T£) - -： - ccss- sH
    [0029] W£00/t6 OAV
    [0030] U800/l6df/IOd 本発明はさ らに上記配列 〔 I〕 をコー ドする D N Aから なるものである。
    [0031] 配列 〔 I〕 におけるア ミ ノ酸残基の一部分は、 蛋白質の 性質を大き く変えない範囲においてア ミ ノ酸を削除し、 置 換し又は付加することによって修飾することができる。 ま た配列 〔 I〕 も しく は修飾された配列 〔 I〕 の全体をコ一 ドする D N Aのみならずその部分をコ一 ドする D N Aも本 発明の範囲に含まれる。
    [0032] また本発明は、 発現ベク タ ーに関するものであり、 上記 の蛋白質をコー ドする D N Aと、 その上流側末端に正しい 方向に連結された適切な遺伝子プロモータ一、 例えば、 動 物細胞での遺伝子発現に良く使われる S V 4Gウィルスの T アンチゲンの初期プロモーターを組込み、 かつ他の外来性 遺伝子の発現に必要な D N A断片をもたせたものを特徴と する ものである。
    [0033] さ らに本発明は、 上記 〔 I〕 の配列で表される蛋白質の 製造法に関する ものであって、 本発明による発現ベクター で宿主細胞を形質転換し、 該形質転換体を培養することに より該蛋白質を生産するこ とを特徴とする ものである。
    [0034] さ らに本発明は、 該形質転換体を培養するこ とによって 得られる蛋白質に関する。 こ こでいう蛋白質とは上記 〔 I〕 のア ミ ノ酸配列の全てを有する蛋白質、 ア ミ ノ酸の一部が 削除、 置換、 挿入により修飾された配列の全てを有する蛋 白質、 およびそれらの配列の部分よりなる ものである。
    [0035] 本発明による 168ア ミ ノ酸残基をコー ドする D N Aを例 えばチャイニーズハムスター卵巣細胞 （C H O) などの動 物細胞中で、 例えば S V40ウィルスの T抗原の初期プロ モーターの下流に連結して発現させることにより、 168ァ ミ ノ酸の全ても しく はその一部の配列を有する蛋白質を宿 主細胞外に分泌生産させることが可能である。 またこの蛋 白質には糖鎖の修飾する部位がないので、 酵母や大腸菌な どの微生物を使って生産することも可能である。 このよう にして生産された蛋白質は MKフア ミ リ ーに属する他の蛋 白質のように骨芽細胞や脳神経細胞の成長分化を促進する 作用を持つ。 したがって、 骨粗ショ ウ症及び痴呆症の治療 剤と して効果が期待される。 また、 この c D N Aをプロ一 ブと してヒ トの骨芽細胞や脳神経細胞、 またはそれらの腫 瘍株から樹立した株細胞の c D NAライブラ リ ーからヒ ト の対立遺伝子を単離することも可能となる。
    [0036] 0 S F - 1蛋白質
    [0037] 本発明による蛋白質は、 マウス頭蓋冠細胞から樹立され た骨芽細胞様細胞である M C 3 T 3 E 1細胞の c D NAラ ィブラ リ ーにおいて特異的に強く発現されるものを、 マウ ス胚性繊維芽細胞株である N I H 3 T 3 と比較対照して選 択された。 さ らにこの得られたマウス〇 S F - 1をコー ド する c D N Aをプローブと してヒ 卜の c D N Aライ ブラ リ ーから ヒ ト O S F - 1をコー ドする c D N Aも選択され た。 それらの c D N Aの塩基配列は 〔Π〕 で表されるもの である。 さ らに、 マウス O S F - 1の組織特異的発現を調 ベるため、 マウスの脳、 筋肉、 腎臓、 肝臓、 脾臓、 胸腺、 肺の各組織での m R N A産生をノーザンハイブリダィゼィ ショ ン法で確認したところ、 MC 3 T 3 E 1細胞以外では 脳細胞でのみ発現が見られた。
    [0038] 0 S F - 1は、 下記の性状を有する新規蛋白質である。
    [0039] ① 翻訳開始点であるメ チォニン残基を含め 168ア ミ ノ酸 残基からなり、 その中に Π%〜18%の高含有率でリ ジン 残基を含み塩基性親水性の高い蛋白質である。
    [0040] ② そのア ミ ノ酸配列中に Ν - グリ コシレーシヨ ン部位は 見いだされない。 .
    [0041] ③ 10個のシスチン残基が見られ高度の高次構造をとつて いるこ とが推察される。
    [0042] ④ 以上の特徵は ΜΚフ ァ ミ リ 一と報告されている細胞 増殖分化に関係している と言われる蛋白質 ΜΚ - 1 と O S F - 1は非常に類似することを示唆する。 ア ミ ノ酸 配列上では Μ Κ - 1 とマウス 0 S F - 1の間に次のよう な 48.3%の相同性が見られる。
    [0043] 1 50 OSF-1: HSSQQYQQOR KKFAAATIJLL IFILAAVDTA EAGKKEKPEK KVKKSDCGEW
    [0044] 51 100 OSF-1: QWSVCVPTSG DCGLGTREGT TG EC QTM KTQRC IPC W KQFG EC
    [0045] * * * * ** *** *** *** **
    [0046] MK-1 ： MGF REGT-CGAQT Q VHC VPCN WK EFGADC
    [0047] 1 32
    [0048] 101 150 OSF-1: YQFQAWGECD LNTA1KT TG SLKRA1HNAD CQKTVTェ S P CGK1T P PQ
    [0049] * * ** ** * * * * ** * * ** * ** * ** * ·
    [0050] MK-1 ： Y FESWGACD GSTGTKARQG TL KARYTAQ CQETェ RVTKP CTSKTKS T
    [0051] 33 82
    [0052] 151 168
    [0053] OSF-1: AESKKKK EG KKQEKMLD
    [0054] * * *
    [0055] MK-1 ： A GKG D
    [0056] 83 90
    [0057] MK - 1 は、 分泌性の蛋白質 （またはポリペプチ ド） で あることが知られており、 レチノイ ン酸支配下のェンプリ ォニッ クカルシノーマ細胞の分化因子であることが示唆さ れており （友村美根子， 門松健治， 村松喬， 生化学， 1989， Voi.61, Να9, Page 1040 ) 、 O S F - 1 も組織特異性が骨 芽細胞と脳細胞である点を除いて MK - 1 に構造が非常に 似ている。 本発明の蛋白質は O S F 一 1のア ミ ノ酸残基の 全てを含むもの、 又は実質的に O S F - 1 と同一の活性を 有する O S F - 1の一部ア ミ ノ酸残基の置換体を含む。
    [0058] 本発明の蛋白質は配列 〔 I〕 の部分よりなる蛋白質と し て分泌されることが可能である。 MK - 1 との類似性から みて Π番目の G in (Q) から 84番目の A rg (R) の間で開 裂をうけて分子量 9 0前後の蛋白質と して分泌される可能 性がある。 したがって、 本発明の蛋白質は、 配列 〔 I〕 の 部分よりなる蛋白質及びそれと実質上同一の活性を有する 一部ァ ミ ノ酸残基の置換体を含む。
    [0059] O S F - 1蛋白質をコー ドする D N A
    [0060] 本発明による蛋白質をコー ドする D N Aは、 前記配列
    [0061] 〔 I〕 をコー ドする塩基配列を有する もの、 並びに実質的 に O S F - 1 と同一の活性を有する O S F - 1の部分も し く は O S F - 1の一部ァ ミ ノ酸残基の置換体をコー ドする 塩基配列を有するものである。
    [0062] 本発明による D N Aの典型的な配列は、 下記の配列 〔Π〕 のものである。
    [0063] ATG-YZG-XCy-CAU-CAU-TAY-CAG-CAG-CAU-CGT-ZGA-AAA-TTT-GCA-GCT- GCC-TTC-Y G-GCA.-TTV-ATT-TTC-ATZ-YTG-GCA-GCT-GTG-GAY-ACT-GCT- GAU-GCZ-GGG^AAG-AAA-GAG-AAA-CCW-GAA-AAA-AAU-GTG-AAU-AAG-TCT- GAC-TGT-GGA-GAA-TGG-CAG-TGG-AGT-GTG-TGY-GTG-CCY-ACC-AGY-GGU- GAC-TGT-GGU-YTG-GGC-ACZ-CGG-GAG-GGC-ACT-CGV-ACT-GGZ-GCY-GAG- TGC-AAU-CAU-ACC - ATG-AAG - ACY-CAG - AGA-TCT - AAG-ATC - CCY - TGC - AAC - TGG - AAG - AAG—CAU-TTT - GGZ - GCX - GAG-TGC - AAU - TAG - CAG - TTC - CAG二 GCY - TGG-GGA-GAA-TGT-GAC-C V-AAy-ACZ-GCC-Y G-AAG-ACC-AGA-ACT-GGZ - AGY-CTG-AAG-CGA-GCY-CTG-CAC-AAT-GCY-GAZ-TGY-CAG-AAU-ACT-GTC- ACC - C - TCC - AAG - CCC - TGT - GGC - AAU-CTV - ACC - AAG - CCC - AAU - CCT - CAA - G U - GAU- TCW - AAG - AAG - AAG - AAA - AAG - GAA- GGC - AAG - AAA - CAG - GAG - AAG- ATG-CTG-GAT-TAA
    [0064] C Π 〕
    [0065] 配列中、 Uは Aか G、 Yは Cか T、 Xは Gか T、 Zは A力、 C、 Vは Gか C、 Wは Tか Aである。
    [0066] マ ウ ス O S F - 1 及び ヒ ト O S F - 1 をコー ドする D N Aの具体例は下記の配列 〔Π - I〕 及び 〔Π - Π〕 で 示される。
    [0067] ATG - TCG -！ TCC一 CAG - - CAG - CAG - CAA - CGT - AGA- AAA - ΤΤΤ一 GCA - GCT -
    [0068] GCC-TTC-CTG-GCA-TTG-ATT-TTC-ATC-TTG-GCA-GCT-GTG-GAC-ACT-GCT- GAG-GCC-GGG-AAG-AAA-GAG-AAA-CCT-GAA-AAA-AAG-GTG-AAA-AAG-TCT.- GAC-TGT-GGA-GAA-TGG-CAG-TGG-AGT-GTG-TGC-GTG-CCT-ACC-AGC-GGG- GAC-TGT-GGA-TTG-GGC-ACC-CGG-GAG-GGC-ACT-CGC-ACT-GGC-GCC-GAG- TGC -AAA- CAG-ACC-ATG-AAG-ACT -CAG-AGA-TGT-AAG-ATC- CCT-TGC-AAC- TGG-AAG-A2^-CAG-TTT-GGA-GCT-GAG-TGC-AAG-TAC-C^-TTC-CAG-GCT- TGG-GGA-GAA-TGT-GAC-CTC-AAT-ACC-GCC-TTG-AAG-ACC-AGA-ACT-GGC- AGC-CTG-AAG-CGA-GCT-CTG-CAC-AAT-GCT-GAC-0 GT-CAG-AAA-ACT-GTC- ACC-ATC-TCC-AAG-CCC-TGT-GGC-AAG-CTC-ACC-AAG-CCC-AAG-CCT-CAA- GCG - GAG - TCA-AAG - AAG- AAG二 AAA - AAG - GAA - GGC - AAG - AAA-CAG - GAG - AAG - ATG-CTG-GAT-TAA
    [0069] 〔n - I〕
    [0070] ATG - CAG - GOT - CAA - CAG-TAC - CAG- CAG - CAG - CGT - CGA - AAA - TTT - GCA - GCT -
    [0071] GCC-TTC-TTG-GCA-TTC-ATT-TTC-ATA-CTG-GCA-GCT-GTG-GAT-ACT-GCT-
    [0072] GAA-GCA-GGG-AAG-A¾A-GAG-AAA-CCA-GAA-AAA-AAA-GTG-AAG-AAG-TCT-
    [0073] GAC-TGT-GGA-GAA-TGG-CAG-TGG-AGT-GTG-TGT-GTG-CCC-ACC-AGT-GGA-
    [0074] GAC-TGT-GGG-CTG-GGC-ACA-CGG-GAG-GGC-ACT-CGG-ACT-GGA-GCT-GAG-
    [0075] TGC-AAG-CAA - ACC-ATG-AAG-ACC-CAG-AGA-TGT-AAG - ATC-CCC - TGC-AAC -
    [0076] TGG - AAG - AAG - CAA - TTT - GGC - GCG - GAG - TGC - AAA - TAC - CAG - TTC - CAG - GCC -
    [0077] TGG-GGA-GAA-TGT-GAC-CTG-AAC-ACA-GCC-CTG-AAG-ACC-AGA-ACT-GGA-
    [0078] AGT-CTG-AAG-CGA-GCC-CTG-CAC-AAT-GCC-GAA-TGC-CAG-AAG-ACT-GTC-
    [0079] ACC-ATC-TCC-AAG-CCC-TGT-GGC-AAA-CTG-ACC-AAG-CCC-AAA-CCT-CL¾JV-
    [0080] GCA-GAA-TCT-AAG-AAG-AAG-AAA-AAG-GAA-GGC-AAG-AAA-CAG-GAG-AAG-
    [0081] ATG-CTG-GAT-TAA
    [0082] 〔 n - n〕
    [0083] 蛋白質のア ミ ノ酸配列が与えられれば、 それをコー ドす る塩基配列はいわゆる遺伝暗号表を参照して容易に定ま り、 また前記したア ミ ノ酸配列をコー ドする種々の塩基配列を 適宜選択するこ とができる。 従って、 本発明による蛋白質 をコー ドする D N Aとは、 その塩基配列が前記配列 〔Π〕 である もの並びにその縮重異性体である。 こ こで、 「縮重 異性体」 とは、 縮重関係にあるコ ドンが使用されている点 以外は塩基配列が同一で同一の蛋白質をコー ドする D N A を意味する ものとする。
    [0084] O S F - 1蛋白質をコー ドする D N Αの取得
    [0085] 本発明による D N Aは、 その塩基配列が定ま っているこ とから、 その D N Aを取得するひとつの手段は、 核酸の化 学合成の方法に従って製造することである。
    [0086] また本発明によるマウス O S F - 1をコー ドする D N A は、 マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞 M C 3 T 3 E 1 (児玉等， 1981, J pn. J. Oi a 1 Biol. , Vo .23, Pages 899- 901)細胞 を直径 emのペ ト リ皿 40枚に 1枚あたり 2.2X 105 個に撒 き込み約 9 日間 °Cで適宜培地を交換し培養後 8 X 1G7 個 になったところで Maniat is等の方法により （Maniatis等， 1982, Mol ecu l ar cloning: A La oratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) 総 R N Aを調製後通常の方法 により m R N Aの精製、 c D N Aの合成、 ク ローン化によ り製造する こ と もできる。
    [0087] またこのマウス由来の c D N Aをプロ一プと してヒ トゃ 他の動物の c D N Aライブラ リ ーから製造することもでき
    [0088] 0 S F - 1蛋白質の発現
    [0089] O S F - 1蛋白質の生産は、 宿主は大腸菌、 酵母、 動物 細胞を用い、 それぞれに対応したプロモーターにより行う こ とができる。 その具体的方法は Maniat is等 （前出） 等に 記載の方法を用いることができる。
    [0090] 以下に実施例により本発明を説明する。 実施例で用いた 手法は次のとおりである。
    [0091] 制限酵素は米国ニュ一 ' イ ングラ ン ド ' バイオラブス社 (New England Biolabs) 、 及び宝酒造から入手し、 そして 特にことわらない限り製造者の指示に従って使用した。 キ 口 シークェンス用デレーン ヨ ンキッ ト、 ク ローニングべク 3 ター P U C 118, T 4 D N A リ ガーゼ及び、 細菌性アル力 リ性ホスファタ一ゼは、 宝酒造から入手し、 製造者の指示 に従って使用した。 c D N A合成システム · プラスはアマ シャム社， イギリ ス， （Amersham) から入手し製造者の指 示に従って使用した。 A MV リバース ト ラ ンスク リ プター ゼ、 m R N A精製キ ッ ト及び、 E c Q R I - N o t I ァダ プタ一はフ アルマシア社， スウェーデン， （Pharmacia) か ら入手し製造者の指示に従って使用した。 ラ ンダムプライ ム ド D N Aラベ リ ングキッ ト はべー リ ンガーマ ンハイ ム 山之内より入手し製造者の指示に従って使用した。 i gtio ク ロ一ニングベク タ一と、 ィ ンビ ト ロノ、0ッ ケージングキッ ト 「ギガパッ ク ゴール ド （G i g a p a c k Gold) 」 は、 ス トラタ ジーン社， 米国， （Stratagene) より入手し製造者の指示 に従って使用した。 大腸菌（E. coli) の形質転換、 D NA のライゲーシヨ ンは Mania tis等 （前掲） により記載された 方法により行った。
    [0092] 図面の簡単な説明
    [0093] 第 1図は、 プラ ス ミ ド p M C 031の構造を示す。
    [0094] 白帯はマウス O S F ― 1の c D N A挿入部を示す。 矢印 はアンピシリ ン耐性遺伝子を示す。 黒丸はプラス ミ ドの複 製開始点を示す。
    [0095] 第 2図は、 プラス ミ ド P M C G31 及び、 10個のデレー シヨ ン ミ ュータ ン トの c D N A挿入部の構造及び、 塩基配 列を決定した領域を示す。
    [0096] 実線は、 各プラス ミ ドに含まれる c D N A挿入部を示す。 矢印は、 塩基配列を決定した領域及び方向を示す。
    [0097] 第 3図は、 p M C l の c D N A挿入部の全塩基配列及 び、 塩基配列から推定されるマウス 0 S F - 1のア ミ ノ酸 配列を示す。
    [0098] 下線は E coR I - Not Iアダプターに由来する部分を示 す。 * * *は転写終止コ ドンを示す。
    [0099] 第 4図は、 ノ ーザンプロ ッティ ングによる、 0 S F - 1 遺伝子の組織特異的発現の検討を示す。
    [0100] 各 レー ン は次の通 り 。 1 ； 胸腺、 2 ； 脾臓、 3 ； 脳、 4 ; 腎臓、 5 ; 肝臓、 6 ; 肺、 7 ; 骨格筋、 8 ;
    [0101] MC 3 T 3 E 1細胞、 9 ; N I H 3 T 3細胞。 28S， 18 S はリ ポソ一ム RN Aの位置を示す。
    [0102] 第 5図は、 プラス ミ ド P H S G757 の構造を示す。
    [0103] 白帯はポリ Aシグナル、 矢印付白帯は S V 40T抗原初期 プロモーター、 矢印はク ロラムフヱニコール耐性遺伝子を 示す。 黒丸はプラス ミ ドの複製開始点を示す。
    [0104] 第 6図は、 p H B R 1の c D Ν Α揷入部の全塩基配列及 び、 塩基配列から推定される ヒ ト O S F - 1のア ミ ノ酸配 列を示す。
    [0105] 発明を実施するための最良の形態
    [0106] 次に実施例を示して本発明をさ らに具体的に説明する。 実 施 例 1 マ ウ ス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞株
    [0107] M C 3 T 3 E 1細胞由来 c D N Aライ ブラ リ 一の作製
    [0108] 約 8 X 107 個のマウス骨芽細胞様細胞株 M C 3 T 3 E 1 一 1.5— 細胞 （児玉等， 1981, Jpn. J. Ora l Biol. , 23, 899 - 901 ) より、 グァニジン法 （Mani at i s等， 前掲） により総 R N A を調製後、 フ ア ルマ シ ア の m R N A精製キ ッ ト を用い m R N Aを調製した。 調製した m R N Aを铸型と して、 c D N A合成システム · プラ ス （アマ シャ ム社） によ り 、
    [0109] 2本鎖 c D N Aを合成した。 合成された 2本鎖 c D N Aに まず E c 0 R I - N 01 I アダプタ一 （フ ア ルマ シア社） を T 4 D N A リ ガーゼを用いて連結し、 次に E co R I で消化 した； I gtlOク ローニ ングベクター （ス トラタジー ン社） を、 T 4 D N A リ ガ一ゼを用いて連結した。 ；i gtlOと連結した c D N Aを、 ス ト ラ 夕 ジー ンのイ ン ビ ト ロノヽ0ッ ケー ジ ング キッ ト 「ギガパッ クゴール ド（G i g a p a c It Gold) 」 を用いて イ ン ビ ト ロ （in v i t ro) でラ ムダフ ァ ー ジにノ、° ッ ケー ジ し、 S M緩衝液 （Mani at i s等， 前掲） 中に保存した。 これ を大腸菌 C 600 株 （国立予防衛生研究所 遺伝子バ ン ク
    [0110] H T 003 )に感染させたところ、 1 gの c D N A当たり、 約 1. 4 X 107 個の一次フ ァージプラークの頻度で c D N Aラ イブラ リ 一が作成された。
    [0111] 実 施 例 2 M C 3 T 3 E 1細胞由来 c D N Aライブラ リ ーの、 N I H 3 T 3細胞（ATCC CRL 1658 ) と の ディ フ ァ レ ン シ ヤ ノレス ク リ ーニ ン グ d i f f e r en t i a l s c r e en i n ) に よ る 、 M C 3 T 3 E 1細胞特異的ク ロー ンの選択 及び、 プラス ミ ドベクター p U C l U への ク ロ ーニ ング M C 3 T 3 E 1細胞自身の mR N A及び、 M C 3 T 3 E
    [0112] 1 細胞 と 同様の方法で調製 したマ ウ ス繊維芽細胞株 N I H 3 T 3細胞（ATCC CRL 1658) の mR N Aを铸型と し て、 AMVリ ノく一ス トラ ンスク リプターゼ （フアルマシア） によりそれぞれ放射性 c D N Aプローブを合成した。 前記 の M C 3 T 3 E 1細胞由来の c D N Aライブラ リ ーのうち、 約 1. 5 X 104 個を、 それぞれの放射性 c D N Aプローブを 用いて、 プラークハイプリ ダイゼーシヨ ン法 （Mania t is等， 前掲） によって、 順次スク リ ーニングし、 M C 3 T 3 E 1 細胞由来の放射性 c D N Aプローブに特異的にハイプリ ダ ィズする 78個のクローンを得た。
    [0113] 次に、 これらのファージク ローンの溶菌物からそれぞれ のファージ D N Aをフヱノール処理に続く ェタノ ール沈殿 によ り精製し （Maniat i s等； 前掲） 、 E coR I で消化、 ァガロースゲル電気泳動により分離後、 c D N A挿入部の みを精製した （Maniatis等， 前掲） 。 これらの c D N A揷 入部を基質と して、 ランダムプライム ド D N Aラベリ ング キッ ト （ベ一リ ンガーマンハイム山之内） を用いてそれぞ れのク ローン由来の放射性プローブを調製した。
    [0114] 他方、 M C 3 T 3 E 1細胞及び、 N I H 3 T 3細胞の m R N A 0. 3 ^を、 ホルムアルデヒ ド変性ァガロース ゲル電気泳動 （Mani at i s等， 前掲） により分離後、 ナイ ロ ン膜 （BYODYNE, Pa l l Bio Suppor t, 米国） に固定した ( aniatis^, 前掲） 0
    [0115] 個 々 の ク ロ ー ン由来の放射性プロ ー ブを用いて、 ノ ー ザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ に よ っ て、 各 ク ロ ー ン の M C 3 T 3 E 1細胞及び、 N I H 3 T 3細胞での発現量を 定量し、 M C 3 T 3 E 1細胞に特異的に発現している 1個 のク ローンを得た。 このク ローンを M C 031 と称する。
    [0116] このフ ァージク ローン M C 031 の c D N A挿入部を、 制 限酵素 E co R I で消化し 5 ' 末端のリ ン酸を細菌性アル力 リ性ホスフ ァターゼ （宝酒造） 処理により除去したク ロー ニングベク タ一 P U C 118 (宝酒造） と、 T 4 D N A リ ガーゼを用いて連結しプラス ミ ド p M C l を得た。 その 構造を第 1図に示す。
    [0117] 実 施 例 3 p M C 031 の c D N A挿入部の塩基配列の 決定
    [0118] p M C 031 を制限酵素 S ph I及び、 B amH I で消化後、 キロシークェンス用デレージヨ ンキッ ト （宝酒造） によつ て 10個のデレ一シヨ ン ミ ュータ ン トを作成した。 これらを、 p M C 031- 1 , p M C 031-2 , p M C 031- 3 , ·■·, p M C 03卜 10と称する （第 2図） 。 アプライ ド ' バイオシステム ズ社， 米国， （App l i ed B i osys t ems) の自動塩基配列解析 装置 （Mode l 370 A) を用いて、 p M C 031 及びこれらのデ レーシ ヨ ン ミ ュータ ン トの H ind mサイ ト側よ り c D N A 挿入部の塩基配列、 それぞれ約 300 塩基対を決定した。 そ の結果得られた c D N A挿入部の全塩基配列及び、 それか ら推定されるア ミ ノ酸配列を第 3図に示す。 また、 この遺 伝子によ ってコ ー ドされる と推定される蛋白質をマウス O S F - 1 と称する。 実 施 例 4 マウス O S F - 1の組織特異的発現の検討 マウス 0 S F - 1 の遺伝子の組織特異的発現をノ 一ザン プロ ッティ ング法によって検討した。
    [0119] ク レア社よ り 購入 した 4週令のマウ ス （ C 57 B L Z 6 N) 10匹の胸腺、 脾臓、 脳、 腎臓、 肺、 肝臓、 骨格筋 か ら、 グァニ ジ ン法 （ M a n i a t i s等， 前掲） によ っ て それぞれの総 R N Aを調製した。 これらの総 R N A及び、 M C 3 T 3 E 1細胞、 N I H 3 T 3細胞より調製した総 R N Aそれぞれ 1 ϋ i«gを、 ホルムアルデヒ ド変性ァガロー スゲル電気泳動により分離後、 ナイ ロ ン膜（BYODYNE, Pal 1 Bio Suppor t)に固定した （Maniatis等， 前掲） 。
    [0120] 他方、 p M C l の c D N A挿入部を E coR I で消化し た後、 ァガロースゲル電気泳動によって精製し （Maniatis 等， 前掲） 、 これを基質と じてべ一リ ンガーマンハイム山 之内のラ ンダムプライム ド D N Aラベリ ングキッ トを用い て放射性プローブを調製した。
    [0121] これらのナイ 口 ン膜とプローブを用いてノ一ザンブロ ッ ティ ングを行った結果、 M C 3 T 3 E 1細胞に強い発現、 脳及び N I H 3 T 3細胞に弱い発現がみられた （第 4図） , 実 施 例 5 ヒ ト O S F - 1遺伝子のク ローニング
    [0122] マウス 0 S F - 1遺伝子を有する p M C 031をプローブ と してヒ ト大脳上側頭回 c D N Aライブラ リ ー （クローン テッ ク社， C L H L 10 a) 4 x ld4 ク ロー ンをプラークハ イブリ ダィゼ一シヨ ン法 （Mani a t i s等， 前掲） により選択 し、 1 個の フ ァ ー ジ ク ロ ー ンを得た。 こ の フ ァ ー ジ ク ロ ー ンを H B R l と称する。 さ らに、 こ の フ ァ ー ジク ローン H B R 1の c D N A挿入部を、 制限酵素 E coR I で 消化 し ク ロ ーニ ングベク タ 一 P U C 118 (宝酒造） と、 T 4 D N A リ ガ一ゼを用いて連結しプラス ミ ド p M C 031 と類似の p H B R 1を得た。
    [0123] 実 施 例 6 p H B R lの c D N A挿入部の塩基配列の 決定
    [0124] p H B R 1を制限酵素 P s t I及び、 B amH I で消化後、 キロシークェンス用デレーシ ヨ ンキッ ト （宝酒造， 前掲） によって 10個のデレージヨ ンミ ュータ ン トを得た。 これら を p H B R - 1， p H B R 1 - 2 , p H B R l - 3， ……， p H B R 1 - 10と称した。 D N Aシークェンシングキッ ト ( S e q u e n a s e Vers i on 2. 0, Uni ted States Biochemi ca l Co r p o r a t o n) を用いて、 p B R 1及びこれらのデレー シ ヨ ン ミ ュータ ン ト H ind mサイ ト側より c D N A揷入部 の塩基配列、 それぞれ約 200塩基対を決定した。 その結果 得られた c D N A挿入部の全塩基配列及び、 それから推定 されるア ミ ノ酸配列を第 6図に示す。
    [0125] 実 施 例 7 0 S F - 1蛋白質を発現する発現ベク ター 及びそのべクタ一を使った同蛋白質の生産
    [0126] 0 S F - 1 の生産は、 特開昭 63 - 7288に記述されてい る増幅された遺伝子によって動物細胞で効率良く 蛋白質を 生産する方法を用いて行った。 〇 S F - 1をこの方法で発 現させるために、 同蛋白質をコ一 ドする c D N Aをカセ ッ トベク ター p H S G (国立予防衛生研究所 遺伝子バン ク登録番号 V E H 7)の S V40ウィルス T抗原初期プロモ一 ターと、 ポリ Αシグナルの間に、 以下のようにして挿入し た。 p H S G747 の S V 40T抗原初期プロモーター上流の E coR I部位を、 E coR I による消化、 末端の Kl enowフラ グメ ン ト （宝酒造） による平滑化、 及びそれに引続く リ ガーゼによる再結合により消失させた。 さ らに、 S V40T 抗原初期プロモータ一とポリ Aシグナル配列の間にある単 — P st l部位を合成 E coR I リ ンカーオリ ゴヌ ク レオチ ド (宝酒造） で置き換え、 同位置に単一 E coR I部位を持つ. イ ンビ ト ロ遺伝子増幅用のプラス ミ ドベク ター p H S G 757 を構築した （第 5図） 。 この E coR I部位に E coR I 部位で挟まれた O S F - 1 c D NA断片を正方向に挿入し プラス ミ ド p O F lを得た。 このプラス ミ ドを制限酵素 B s t X Iで消化することにより、 以下のような両端に非対 称性粘着性末端を持つた 0 S F - 1の発現単位 D N A断片 を得ることができる。
    [0127] 5' CTGG 0 S F - 1発現 CCACGGGG 3' 3' CCCCGACC 単位 D N A断片 GGTG 5'
    [0128] Cm) しかし、 p 0 F 1を直ちに B s t X Iで消化したのでは、 同 プラス ミ ドの他の B stX I消化断片と分子量が近似してお り同断片が混在して分離精製が困難なため、 ポリ Aシグナ ル配列下流の単一 X ho I部位にプラス ミ ド p H S G ll (国 立予防衛生研究所 遺伝子バンク 登録番号 V E 9)を挿 入し、 プラス ミ ド p O F 3を構築した。
    [0129] このようにして得た 〔m〕 の断片を、 コス ミ ドベクタ一 p H S G 293 (国立予防衛生研究所 遺伝子バンク 登録番 号 V E 046)の D N Aより B s t X I消化により調整した下記 の D N A断片 〔IV〕 と 20 : 1の分子比で混合し上記特開昭 に記述されている方法により T 4 リガーゼによりタ ンデム に連結した。
    [0130] 5' CTGG 不ォ ナ + c 0 s CCACGGGG 3' 3' CCCCGACC サイ ト D N A断片 GGTG 5'
    [0131] 〔IV〕 こ う して得られた長鎖の D N A断片を記述の方法により (Takeshi ta e t a I, 1988, Gene, Vo^.71, Pages 9— 18) 、 ラムダファ一ジ粒子にパッケージし大腸菌 O m206 (工業技 術院微生物工業技術研究所 微ェ研菌寄第 9110号 （FERM P- 9110) )細胞内で増幅後ラムダフ ァ ー ジ粒子内に細胞内 パッケージを行いコス ミ ド D N Aと して大量に調整した。 この D N Aを常法によ り リ ン酸カルシウム共沈法によ り チャ イニーズハムスター卵巣細胞株 （ C H O株） に導入 し、 G 8 耐性のク ロー ンを選択した。 さ らに得られた各 ク ローンから Man i a t i s等 （前掲） の方法により総 R N Aを 調整し O S F - 1 c D N A断片をプローブにしノ ーザンブ ロ ッテイ ング法 （Man i a ί i s等， 前掲） によ り同遺伝子を高 い効率で発現する株を得た。 この選択した O S F - 1産生 株を 10%の牛胎児血清を含む - M E M培地 （G I B C 0 ) で 時間培養し、 その培養上清中に、 O S F - 1を検出し た。
    [0132] 産業上の利用可能性
    [0133] 本発明によれば、 骨細胞分化形成能を有する新規な蛋白 質、 それをコー ドする D N Aおよびその遺伝子工学的製法 によるこの蛋白質の製造方法が提供される。 本発明によつ て提供される新規な蛋白質は老人性の疾患と しての骨粗 ショ ゥ症および痴呆症の治療に利用される可能性を有して いる。
    权利要求:
    Claims

    請 求 の 範 囲
    1) 下記の配列 〔 I〕 で表されるァ ミ ノ酸配列の全体、 そ の部分的に修飾されたア ミ ノ酸配列の全体またはそれら の部分を有する蛋白質。
    Met— A*2 - Gin— Gin - Tyr— Gin - Gin— Gin - A g— Arg-Lys - Phe-Ala— Ala— Ala- Phe- Leu - Ala - A*3— lie - Phe -！: le - Leu— Ala-Ala- Val - Asp-Thr-Ala - Glu - Ala - Glv - Lys - I vs - Glu— Lys— Pro - Glu - Lys— Lys - Val - Lys - Lys— Ser - Asp-Cys-Gly-Glu-Trp-Gln-Trp-Ser-Val-Cys-Val-Pro-Thr-Ser-Gly- Asp - Cys - Gly - Leu - Gly- Thr- Arg - Glu— Gly - Thxr—Arg - Thr— Gly - Ala - Glii - Cys - IiVS— Gin - Thir— Met - Iiys -! Thr— Gin - Arg— Cys— Lys -ェ le - Pro— Cys - Asn— Trp - Lys - Lys - Gin - Phe— Gly - Ala - Glu— Cys— Lys - Tyr - Gin— Phe - Gin - Ala - T p - Gly - Glu - Cys -Asp-Leu-Asn-Thr-Ala-I^ -Lys-Thr-Axg-Thr-Gly- Ser-Leu-Lys-Arg-A a-I^u-His-Asn^Ala-A*4-Cys-Gln-Lys-Thr-Val- Thr -ェ le - Ser— Lys - Pro - Cys— Gly - Lys Leu— Thr - Lys - Pro— Lys - Pro— Gin— Ala"Glu-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lvs--Glu-Gly--Ly3-Ijys-Gln-Glu-Lys- Met-Leu-Asp
    〔 I〕 配列中、 A * 1 は S e rか G I n、 A * 2 は S e rか A 1 a、 A * 3 は L e uか P h e、 A* 4 は A s pか G 1 u、 である。
    2) 下記の配列 〔 I 一 I〕 で表される請求項 1記載の蛋白 M t-Ser-Ser-Gln-Gln-Tyr-Gln-Gln-G n-Arg-Arg-Lys-Phe-Ala-Ala- Ala— Phe - Leu— Ala - Leu -ェ le - Phe—ェ le - Leu— Ala— Ala - Val - Asp - Thi: - Ala- Gl -Ala-Gly-Lys-Lys-Glu-Lys-Pro-Glu-Lys-Lys-Val-Lys-Lys-Ser- Asp-Cys-Gly-Gl -Trp-Gln-Trp-Ser-Val-Cys-Val-Pro-Thr-Ser-Gly- Asp-Cys-Gly-Le -Gly-Thr-Arg-Glu-Gly-Thr-Arg-Thr-Gly-Ala-Glu- Cys— Iiys - Gin - Th - Met— Lys - Thi: - Gin— Arg - Cvs - Lys—ェ le - Pro - Cys— Asii- Trp - Lys - Lys - Gin— Phe - Gly - Ala - Glu - Cys - Iiys - Tyr - Gin— Phe - Gin— Ala- Trp - Glv - Glu - Cys— Asp— Leu - Asn - Th -Ala - Leu - Lvs—Thr - A g-Thr—Gly- Sea: - Leu - Lys— Arg - Ala - Leu - His— Asn— Ala - Asp— Cys - Gin - Lys— Thr— Val- Thr— lie - Ser - Lys - Pro— Cys - Gly— Lys - Leu - Thr— Lys - Pro - Lys-Pro - Gin- Ala-Gl -Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-Gly-Lys-Lys -Gln-Glu-Lys - Met - Leu— Asp
    〔 I - I〕
    3) 下記の配列 〔 1 — Π〕 で表される請求項 1記載の蛋白 質。
    Met - Gin - Ala - Gin - Gin— Tyr - Gin - G1II G1TI Arg- Arg - Lys - Phe - Ala - Ala - Ala— Phe - Leu - Ala - Phe -ェ le - Phe—ェ le - - Ala - Ala - Val— Asp - Thr - Ala - Glu - Ala - Gly- Lys - Lys- Glu- Lys - Pro - Glu - Lys- Lys -Val-Lys-Lys-Ser- Asp - Cys - Gly - Glu- Trp- Gin— Trp - Ser - Val— Cys - Val - Pro— Thr— Sear - Gly - Asp-Cys-Gly-Leu-Gly-Thr-Arg-Glu-Gly-Thr-Arg-Thr-Glv-Ala-Glu- Cvs - Lvs - Gin - Thr- Met - Lys - Thr— Gin- Arg - Cvs - L s -ェ le— Pro - Cys— Asn- Trp- Iiys- Lys- Gin- Phe - Gly- Ala - Glu - Cys - Lvs - Tyr - Gin - Phe- Gin- Ala - Trp - Gly - Glu— Cvs - Asp— Leu - Asn - Thr - Ala - Leu - Ijys— Thr - Arg— Thr - Gly— Ser-Leu - Lys— ArCT-Ala— Leu - His— Asn— AJLa— Glu-Cys - Gin - IJVS Thr— Val - Thr -ェ le - Sear— - Pro - Cys - Gly - Lys - Leu - Thr - Lys— Pro - Lys - Pro - Gin— Ala— Glu - Sei: - Lys - Lvs - Lys - Lvs - Lys - Glu - Gly - Lys - Lvs— Gin - GITI - Lys—
    〔 I - n〕
    4) 請求項 1記載の配列 〔 I〕 の全体、 部分的に修飾され た配列の全体またはそれらの部分をコー ドする D N A。
    5) 下記の配列 〔 Π〕 からなる塩基配列の全体またはその 部分からなる請求項 4記載の D Ν Α。
    ATG-YZG-XCY-CAU-CAU-TAY-CAG-CAG-CAU-CGT-ZGA-AAA-TTT-GCA-GCT- GCC-TTC-YTG-GCA-TTV-ATT-TTC-ATZ-YTG-GCA-GCT-GTG-GAY-ACT-GCT- GAU-GCZ-GGG-AAG-AAA-GAG-AAA-CC -GAA-AAA-AAU-GTG-AAU-AAG-TCT- GAC-TGT-GGA-GAA-TGG-CAG-TGG-AGT-GTG-TGY-GTG-CCY-ACC-AGY-GGU- GAC-TGT-GGU-YTG-GGC-ACZ-CGG-GAG-GGC-ACT-CGV-ACT-GGZ-GCY-GAG- TGC-AAU-CAU-ACC-ATG-AAG-ACY-CAG-AGA-TGT-AAG-ATC-CCY-TGC-AAC- TGG-AAG-AAG-CAU-TTT-GGZ-GCX-GAG-TGC-AAU-TAC-CAG-TTC-CAG-GCY- TGG-GGA-GAA-TGT-GAC-C V-AAY-ACZ-GCC-YTG-AAG-ACC-AGA-ACT-GGZ- AGY-CTG-AAG-CGA-GCY-CTG-C¾C-AAT-GCY-GAZ-TGY-CAG-AAU-ACT-GTC- ACC-ATC-TCC-AAG-CCC-TGT-GGC-AAU-C V-ACC-AAG-CCC-AAU-CCT-CAA- GCU - GAU - TCW - AAG - AAG-AAG - AAA - AAG - GAA - GGC-AAG - AAA-CAG-GAG-AAG - ATG-CTG-GAT-TAA
    〔n〕 配列中、 Uは Aか G、 Yは Cか T、 Xは Gか T、 Zは A か C、 Vは Gか C、 Wは Tか Aである。
    6) 下記の配列 〔Π— I〕 からなる請求項 4記載の D N A
    ATG - TCG-TCC - CAG - - CAG - CAG - CAA-CGT - AGA - AAA - TTT - GCA - GCT -
    GCC-TTC-CTG-GCA-TTG-ATT-TTC-ATC-TTG-GCA-GCT-GTG-GAC-ACT-GCT-
    GAG-GCC-GGG-AAG-AAA-GAG-AAA-CCT-GAA-AAA-AAG-GTG-AAA-AAG-TCT-
    GAC-TGT-GGA-GAA-TGG-CAG-TGG-AGT-GTG-TGC-GTG-CCT-ACC-AGC-GGG-
    GAC-TGT-GGA-TTG-GGC-ACC-CGG-GAG-GGC-ACT-CGC-ACT-GGC-GCC-GAG-
    TGC - AAA - CAG - ACC— ATG - AAG - ACT—CAG-AGA_TGT_AAG_ATC_CCT-TGC_AAC_
    TGG - AAG - AAG - CAG-TTT - GGA - GCT - GAG -: TGC - AAG - TAC - CAG-TTC-CAG - GCT -
    TGG-GGA-GAA-TGT-GAC-CTC-AAT-ACC-GCC-TTG-AAG-ACC-AGA-ACT-GGC-
    AGC-CTG-AAG-CGA-GCT-CTG-CAC-AAT-GCT-GAC-TGT-CAG-AAA-ACT-GTC-
    ACC-ATC-TCC-AAG-CCC-TGT-GGC-AAG-CTC-ACC-AAG-CCC-AAG-CCT-CAA-
    GCG-GAG-TCA-AAG-AAG-AAG-AAA-AAG-GAA-GGC-AAG-AAA-CAG-GAG-AAG-
    ATG-CTG-GAT-TAA
    〔n— I〕
    7) 下記の配列 〔H— Π〕 からなる請求項 4記載の D N A
    ATG-CAG - GCT - CAA - CAG - TAC - CAG - CAG-CAG - CGT - CGA - AAA - TTT - GCA - GCT - GCC-TTC-TTG-GCA-TTC-ATT-TTC-ATA-CTG-GCA-GCT-GTG-GAT-ACT-GCT- GAA-GCA-GGG-AAG-AAA-GAG-AAA-CCA-GAA-AAA-AAA-GTG-AAG-AAG-TCT- GAC-TGT-GGA-GAA-TGG-CAG-TGG-AGT-GTG-TGT-GTG-CCC-ACC-AGT-GGA- GAC-TGT-GGG-CTG-GGC-ACA-CGG-GAG-GGC-ACT-CGG-ACT-GGA-GCT-GAG- TGC - AAG - CAA-ACC- ATG-AAG - ACC - CAG-AGA— TGT - AAG-ATC-CCC - TGC-AAC- TGG - AAG - AAG - CAA- !TTT - GGC - GCG - GAG - TGC - AAA- TAC - CAG - TTC - CAG - GCC - TGG-GGA-GAA-TGT-GAC-CTG-AAC-ACA-GCC-CTG-AAG-ACC-AGA-ACT-GGA- AGT-CTG-AAG-CGA-GCC-CTG-CAC-AAT-GCC-GAA-TGC-CAG-AAG-ACT-GTC- ACC-ATC-TCC-AAG-CCC-TGT-GGC-AAA-CTG-ACC-AAG-CCC-AAA-CCT-CAA- GCA-GAA-TCT-AAG-AAG-AAG-AAA-AAG-GAA-GGC-AAG-AAA-CAG-GAG-AAG- ATG-CTG-GAT-TAA
    〔Π—！！〕 8) 請求項 1記載の蛋白質をコー ドする D N A配列を有す るプラス ミ ドベク タ一。
    9) 請求項 1記載の蛋白質をコー ドする D N A配列を有す る発現べク タ一で形質転換した宿主を培養することを特 徴とする請求項 1記載の蛋白質を生産する方法。
    1 0 ) 請求項 1乃至 3のいずれかの項に記載の蛋白質および 製薬的に許容しう る担体または希釈剤を含む医薬。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    IE912281A1|1992-01-01|
    PT98109A|1992-07-31|
    IL98653D0|1992-07-15|
    AU8078491A|1992-01-23|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-01-09| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU BB BG BR CA CS FI HU KR LK MC MG MW NO PL RO SD SU US |
    1992-01-09| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE BF BJ CF CG CH CI CM DE DK ES FR GA GB GN GR IT LU ML MR NL SE SN TD TG |
    1994-02-28| NENP| Non-entry into the national phase in:|Ref country code: CA |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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